Принципы культивирования микроорганизмов - микробиология с техникой микробиологических исследований. Размножение бактерий и принципы их культивирования

Метаболизм микроорганизмов.

Для роста и размножения микроорганизмы нуждаются в веществах, используемых для построения структурных компонентов клетки и получения энергии. Метаболизм (т.е. обмен веществ и энергии) имеет две составляющих- анаболизм и катаболизм . Анаболизм- синтез компонентов клетки (конструктивный обмен ). Катаболизм- энергетический обмен, связан с окислительно- восстановительными реакциями, расщеплением глюкозы и других органических соединений, синтезом АТФ. Питательные вещества могут поступать в клетку в растворимом виде (это характерно для прокариот)- осмотрофы , или в виде отдельных частиц- фаготрофы .

Основным регулятором поступления веществ в бактериальную клетку является цитоплазматическая мембрана. Существует четыре основных механизма поступления веществ: -пассивная диффузия - по градиенту концентрации, энергонезатратная, не имеющая субстратной специфичности;

- облегченная диффузия - по градиенту концентрации, субстратспецифичная, энергонезатратная, осуществляется при участии специализированных белков пермеаз ;

- активный транспорт- против градиента концентрации, субстратспецифичен (специальные связывающие белки в комплексе с пермеазами), энергозатратный (за счет АТФ), вещества поступают в клетку в химически неизмененном виде;

- транслокация (перенос групп)- против градиента концентрации, с помощью фосфотрансферазной системы, энергозатратна, вещества (преимущественно сахара) поступают в клетку в форфорилированном виде.

Основные химические элементы- органогены , необходимые для синтеза органичеких соединений- углерод, азот, водород, кислород.

В зависимости от источника потребляемого углерода микробы подразделяют на аутотрофы (используют CO2) и гетеротрофы (используют готовые органические соединения). В зависимости от источника энергии микроорганизмы делят на фототрофы (энергию получают за счет фотосинтеза- например, цианобактерии) и хемотрофы (энергия добывается за счет химических, окислительно- восстановительных реакций). Если при этом донорами электронов являются неорганические соединения, то это литотрофы , если органические- органотрофы . Если бактериальная клетка в состоянии синтезировать все необходимые для жизнедеятельности вещества, то это прототрофы . Если бактерии нуждаются в дополнительных веществах (факторах роста), то это ауксотрофы. Основными факторами роста для труднокультивируемых бактерий являются пуриновые и пиримидиновые основания, витамины, некоторые (обычно незаменимые) аминокислоты, кровяные факторы (гемин) и др.

Дыхание микроорганизмов.

Путем дыхания микроорганизмы добывают энергию. Дыхание- биологический процесс переноса электронов через дыхательную цепь от доноров к акцепторам с образованием АТФ. В зависимости от того, что является конечным акцептором электронов, выделяют аэробное и анаэробное дыхание. При аэробном дыхании конечным акцептором электронов является молекулярный кислород (О 2), при анаэробном- связанный кислород (-NO 3 , =SO 4 , =SO 3).

Аэробное дыхание донор водорода H 2 O

Анаэробное дыхание

нитратное окисление NO 3

(факультативные анаэробы) донор водорода N 2

сульфатное окисление SO 4

(облигатные анаэробы) донор водорода H 2 S

По типу дыхания выделяют четыре группы микроорганизмов.

1.Облигатные (строгие) аэробы . Им необходим молекулярный (атмосферный) кислород для дыхания.

2.Микроаэрофилы нуждаются в уменьшенной концентрации (низком парциальном давлении) свободного кислорода. Для создания этих условий в газовую смесь для культивирования обычно добавляют CO 2 , например до 10- процентной концентрации.

3.Факультативные анаэробы могут потреблять глюкозу и размножаться в аэробных и анаэробных условиях. Среди них имеются микроорганизмы, толерантные к относительно высоким (близких к атмосферным) концентрациям молекулярного кислорода - т.е. аэротолерантные, а также микроорганизмы которые способны в определенных условиях переключаться с анаэробного на аэробное дыхание.

4.Строгие анаэробы размножаются только в анаэробных условиях т.е. при очень низких концентрациях молекулярного кислорода, который в больших концентрациях для них губителен. Биохимически анаэробное дыхание протекает по типу бродильных процессов, молекулярный кислород при этом не используется.

Аэробное дыхание энергетически более эффективно (синтезируется большее количество АТФ).

В процессе аэробного дыхания образуются токсические продукты окисления (H 2 O 2 - перекись водорода, -О 2 - свободные кислородные радикалы), от которых защищают специфические ферменты, прежде всего каталаза, пероксидаза, пероксиддисмутаза . У анаэробов эти ферменты отсутствуют, также как и система регуляции окислительно- восстановительного потенциала (rH 2).

Основные методы создания анаэробных условий для культивирования микроорганизмов.

1.Физический- откачивание воздуха, введение специальной газовой безкислородной смеси (чаще- N 2 - 85%, CO 2 - 10%, H 2 - 5%).

2.Химический- применяют химические поглотители кислорода.

3.Биологический- совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов (аэробы поглощают кислород и создают условия для размножения анаэробов).

4.Смешанный- используют несколько разных подходов.

Необходимо отметить, что создание оптимальных условий для строгих анаэробов- очень сложная задача. Очень непросто обеспечить постоянное поддержание безкислородных условий культивирования, необходимы специальные среды без содержания растворенного кислорода, поддержание необходимого окислительно- восстановительного потенциала питательных сред, взятие и доставка, посев материала в анаэробных условиях.

Существует ряд приемов, обеспечивающих более подходящие условия для анаэробов- предварительное кипячение питательных сред, посев в глубокий столбик агара, заливка сред вазелиновым маслом для сокращения доступа кислорода, использование герметически закрывающихся флаконов и пробирок, шприцев и лабораторной посуды с инертным газом, использование плотно закрывающихся эксикаторов с горящей свечой. Используются специальные приборы для создания анаэробных условий- анаэростаты. Однако в настоящее время наиболее простым и эффективным оборудованием для создания анаэробных и микроаэрофильных условий является система “Газпак” со специальными газорегенерирующими пакетами, действующими по принципу вытеснения атмосферного воздуха газовыми смесями в герметически закрытых емкостях.

Основные принципы культивирования микроорганизмов на питательных средах.

1.Использование всех необходимых для соответствующих микробов питательных компонентов.

2.Оптимальные температура, рН, rH 2 , концентрация ионов, степень насыщения кислородом, газовый состав и давление.

Микроорганизмы культивируют на питательных средах при оптимальной температуре в термостатах, обеспечивающих условия инкубации.

По температурному оптимуму роста выделяют три основные группы микроорганизмов.

1.Психрофилы- растут при температурах ниже +20 градусов Цельсия.

2.Мезофилы- растут в диапозоне температур от 20 до 45 градусов (часто оптимум- при 37 градусах С).

3.Термофилы- растут при температурах выше плюс 45 градусов.

Краткая характеристика питательных сред.

По консистенции выделяют жидкие, плотные (1,5- 3% агара) и полужидкие (0,3- 0,7 % агара) среды.

Агар- полисахарид сложного состава из морских водорослей, основной отвердитель для плотных (твердых) сред. В качестве универсального источника углерода и азота применяют пептоны - продукты ферментации белков пепсином, различные гидролизаты- мясной, рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.

По назначению среды разделяют на ряд групп:

Универсальные (простые), пригодные для различных нетребовательных микроорганизмов (мясо- пептонный бульон- МПБ, мясо- пептонный агар- МПА);

Специальные- среды для микроорганизмов, не растущих на универсальных средах (среда Мак- Коя на туляремию, среда Левенштейна- Иенсена для возбудителя туберкулеза);

Дифференциально- диагностические- для дифференциации микроорганизмов по ферментативной активности и культуральным свойствам (среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гисса);

Селективные (элективные)- для выделения определенных видов микроорганизмов и подавления роста сопутствующих- пептонная вода, селенитовая среда, среда Мюллера.

По происхождению среды делят на естественные, полусинтетические и синтетические.

Рост и размножение микроорганизмов.

Бактериальные клетки размножаются в результате деления. Основные стадии размножения микробов в жидкой среде в стационарных условиях:

Лаг- фаза (начальная стадия адаптации с медленным темпом прирости биомассы бактерий);

Экспоненциальная (геометрического роста) фаза с резким ростом численности популяции микроорганизмов (2 в степеии n);

Стационарная фаза (фаза равновесия размножения и гибели микробных клеток);

Стадия гибели - уменьшение численности популяции в связи с уменьшением и отсутствием условий для размножения микроорганизмов (дефицит питательных веществ, изменение рH, rH 2 , концентрации ионов и других условий культивирования).

Данная динамика характерна для периодических культур с постепенным истощением запаса питательных веществ и накоплением метаболитов.

Если в питательной среде создают условия для поддержания микробной популяции в экспоненциальной фазе- это хемостатные (непрерывные) культуры .

Характер роста бактерий на плотных и жидких питательных средах: сплошной рост, образование колоний, осадок, пленка, помутнение.

Чистая культура - популяция одного вида микроорганизмов.

Основные принципы получения чистых культур: механическое разобщение, рассев, серийные разведения, использование элективных сред, особых условий культивирования (с учетом устойчивости некоторых микробов к определенным температурам, кислотам, щелочам, парциальному давлению кислорода, рН и мн.др).

Конец работы -

Эта тема принадлежит разделу:

Лекции по микробиологии

Лекция история развития микробиологии вирусологии и иммунологии предмет методы задачи.. введение микробиология от греч micros малый bios жизнь logos учение т е учение о малых формах жизни наука изучающая организмы неразличимые..

Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ:

Что будем делать с полученным материалом:

Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:

Все темы данного раздела:

Идентификация
Основные фено- и генотипические характеристики, используемые для классификации микроорганизмов, используются и для идентификации, т.е. установления их таксономического положения и прежде всего в

Морфология бактерий
Прокариоты отличаются от эукариот по ряду основных признаков. 1.Отсутствие истинного дифференцированного ядра (ядерной мембраны). 2.Отсутствие развитой эндоплазматической с

Щие бактерии
2.Изгибающиеся бактерии с тонкими стенками, подвиж- Treponema ность связана с наличием осевой нити- спирохетыBorrelia, Leptospira 3.Ригидные бактерии с толстыми с

Строение бактериальной клетки
Обязательными органоидами являются: ядерный аппарат, цитоплазма, цитоплазматическая мембрана. Необязательными (второстепенными) структурными элементами являются: клето

Морфологическая характеристика грибов
Грибы и простейшие имеют четко ограниченное ядро и относятся к эукариотам. Грибы крупнее бактерий, в эволюционном плане близки к растениям (наличие клеточной стенки, содержащей хитин или целлюлозу,

Морфологическая характеристика простейших
Имеют эукариотическое строение клетки и значительно более сложную функциональную и морфологическую организацию по сравнению с бактериями и грибами. Снаружи тело простейших покрывает эластичная и ри

Химическая структура, биохимические свойства и ферменты бактерий
Клетка- универсальная единица живой материи. По химическому составу существенных отличий прокариотических и эукариотических клеток нет. Химические элементы, входящие в состав живой материи

Генетика бактерий и вирусов
Молекулярная биология, изучающая фундаментальные основы жизни, является в значительной степени детищем микробиологии. В качестве основных объектов изучения в ней используют вирусы и бактерии, а осн

Медицинская биотехнология и генная инженерия. Микробиологические основы антимикробной профилактики и терапии
Достижения научно- технического прогресса способствовали развитию новых биологических технологий создания диагностических, лечебных и профилактических препаратов, решению проблем сбалансированности

Экология микроорганизмов
Микроорганизмы распространены повсюду. Они заселяют почву, воду, воздух, растения, организмы животных и людей- экологические среды обитания микробов. Выделяют свободноживущие и пара

Учение об инфекции
Исторически слово “инфекция” (лат.inficio- заражать) впервые было введено для обозначения венерических болезней. Инфекция- совокупность всех биологических явлений и

Иммунитет, виды и формы. Структура иммунной системы. Факторы неспецифической защиты
Первоначально иммунология возникла как наука о невосприимчивости (иммунитете) к инфекционным болезням. Наиболее существенный вклад в ее создание внесли И.И.Мечников (фагоцитарная или клеточная теор

Система интерферонов
Интерфероны- синтезируемые различными клетками организма гликопротеиды широкого спектра биологической активности (прежде всего антивирусной), быстрый ответ организма на получение клетками неспец

Киллерные клетки
В обеспечении видового иммунитета существенную роль принадлежит Т- цитотоксическим лимфоцитам (Т- киллерам), а также главной системе гистосовместимости (подробнее- в следующих лекциях

Иммунная система
Иммунная система- совокупность органов, тканей и клеток, обеспечивающих клеточно- генетическое постоянство организма. Принципы антигенной (генетической) чистоты основываются

Антигены, основные свойства. Антигены гистосовместимости. Процессинг антигенов
Антигены- вещества различного происхождения, несущие признаки генетической чужеродности и вызывающие развитие иммунных реакций (гуморальных, клеточных, иммунологической толерантнос

Гуморальный иммунитет. Иммуноглобулины. Роль антител в иммунном ответе. Реакция антиген- антитело, ее применение
Основными формами иммунного ответа на попадание антигена в организм являются: биосинтез антител, образование клеток иммунной памяти, реакция гиперчувствительности немедленного типа, реакция

Т- и В- лимфоциты. Рецепторы, субпопуляции. Кооперация клеток в иммунном ответе
К клеткам иммунной системы относят лимфоциты, макрофаги и другие антиген- представляющие клетки (А- клетки, от англ. accessory- вспомогательный), а также так называемую третью популяцию к

В- лимфоциты
Существует несколько подтипов В- лимфоцитов. Основная функция В- клеток- эффекторное участие в гуморальных иммунных реакциях, дифференциация в результате антигенной стимуляции в плазматические клет

Иммунный статус макроорганизма. Методы оценки
Состояние иммунной системы имеет важнейшее значение в обеспечении гомеостаза организма, защите от всего генетически чужеродного. Иммунный статус определяет эффективность и согласованность

Иммунодефициты
Иммунная система обладает особыми физиологическими механизмами функционирования (распознавание антигена, активация иммунокомпетентных клеток, их пролиферация, дифференцировка и иммунорегуляция). Ес

Первичные (врожденные) иммунодефициты
В основе первичных (врожденных) иммунодефицитов - генетический дефект, который может реализоваться на разных стадиях развития иммунокомпетентных клеток - стволовой клетки, этапах дифференциа

Вторичные (приобретенные) иммунодефициты
Вторичные или приобретенные иммунодефициты возникают вследствие какого- либо тяжелого заболевания (т.е. как правило при ранее нормальном иммунном статусе). К основным причинам возникн

Основы иммунотерапии и иммунопрофилактики
Иммунотерапия- метод лечения, при котором осуществляется воздействие на иммунную систему: подавление иммунного ответа (иммуносупрессия), стимуляция ответа (иммуностимуляция), восстановление

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Выращивание микроорганизмов на питательных средах называют культивированием (от лат. cultus – выращивание), а развившиеся в результате микроорганизмы – культурой. При развитии в жидкой среде культуры образуют суспензию, осадок или плёнку, а при развитии на плотной среде – колонии. Культура может быть чистой – содержать потомство клетки только одного вида и накопительной – состоять преимущественно из клеток одного вида микроорганизмов.
Внесение клеток микроорганизмов (посевного материала – инокулята) в стерильную питательную среду для получения чистой или накопительной культуры называют посевом . Перенесение уже выращенных клеток из одной среды в другую (стерильную) называют пересевом , или пассированием .
Обычно микроорганизмы выращивают при определенной постоянной температуре в термостатах (деревянных или металлических шкафах) или термостатных комнатах. В тех и других постоянная температура поддерживается с помощью терморегуляторов.
Культивирование при определенной температуре называется инкубацией , или инкубированием .
Выращивают микроорганизмы в стеклянной посуде: пробирках, колбах или чашках Петри. Для этого стеклянную посуду, не бывшую в употреблении, очищают от щёлочи кипячением в растворе, содержащем бихромат калия K 2 Cr 2 O 7 (6 %) или концентрированную серную кислоту Н 2 SO 4 (6 %).
В пробирках микроорганизмы культивируют как в жидких, так и на плотных средах. Жидкой средой для аэробных культур заполняют обычно 1/3 пробирки, для анаэробных 2/3. Если плотная среда в пробирках предназначена для последующего выращивания микроорганизмов, при подготовке к стерилизации её наливают на 1/3…1/4 объёма пробирок.
После стерилизации пробирки с ещё не застывшей средой раскладывают на ровной поверхности стола в наклонном (под небольшим углом) положении для получения скошенной поверхности агара. Это так называемые косяки – косые или скошенные среды.
Плотная среда, застывшая при вертикальном положении пробирки, называется столбиком . Столбики питательной среды, занимающей от 1/3 до 1/2 объёма пробирки, используют для посева культуры уколом . Столбики питательной среды, занимающие 2/3 объёма пробирки, после стерилизации применяют для заливки стерильных чашек Петри, предназначенных для микробиологических посевов.
Пробирки со средами и культурами во время работы устанавливают в штативы; пробирки со средами, подготовленными к стерилизации, помещают в проволочные корзины или металлические ведра с отверстиями; пробирки с культурами при инкубации или хранении – в картонные коробки.
При культивировании микроорганизмов в колбах используют только жидкие питательные среды. Для аэробных микроорганизмов среду наливают тонким слоем (например, 30 мл в колбы Эрленмейера на 100 мл), для анаэробных микроорганизмов колбу заполняют на 2/3 объёма.
В чашках Петри микроорганизмы культивируют лишь на плотных средах. Высота этой посуды – около 1,5 см, диаметр – от 8 до
10 см, причём диаметр верхней чашки (она служит крышкой) несколько больше диаметра нижней.
2.1 Техника посева и пересева культур микроорганизмов
Посев (и пересев) микроорганизмов проводят при соблюдении определенных правил стерильности, которые необходимо выполнять, чтобы предохранить исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами и не загрязнять окружающую среду исследуемыми культурами микроорганизмов.
2.1.1 Посев на плотные среды в чашки Петри
Посев в чашки Петри проводится поверхностным и глубинным способами.
2.1.1.1Поверхностный способ посева Стерильную твердую питательную среду расплавляют на водяной бане в колбе и охлаждают до температуры 50°С.
Вынимают чашки Петри из бумаги, в которой они стерилизовались, и ставят их на ровную горизонтальную поверхность.
Берут колбу с охлажденной до температуры 50°С питательной средой, вынимают ватную пробку, обжигают на пламени горелки края пробирки и держат ее в наклонном положении.
Приоткрывают крышку чашки Петри левой рукой, а правой рукой наливают среду на дно чашки Петри, заполняя всю ее поверхность (рисунок 1).

Рисунок 1 – Заливка чашки Петри агаром
Оставляют чашку Петри на столе до полного застывания среды, затем ставят в термостат на 15…20 мин для подсушивания.
Посев на чашки с агаром производят штрихом при помощи петли либо втиранием стеклянным или металлическим шпателем.
При посеве петлёй ею захватывают небольшое количество инокулята и легко проводят по поверхности агара, нанося ряд параллельных линий или волнообразную черту (посев штрихом).
При посеве шпателем его вынимают из бумаги и берут в правую руку. Приоткрывают крышку чашки Петри левой рукой и вносят в нее шпатель.
Размазывают каплю посевного материала (предварительно внесенную пипеткой или бактериологической петлёй) шпателем вращательными движениями по поверхности агаровой пластинки (рису-
нок 2). Надавливать шпателем на твердую среду не следует, так как можно ее повредить.

Рисунок 2 – Посев шпателем
2.1.1.2 Глубинный способ посева
Приоткрывают стерильную чашку Петри и помещают петлей или пипеткой каплю посевного материала на дно чашки.
Расплавляют агаризованную питательную среду в пробирке или колбе и охлаждают ее до температуры 45°С.
Обжигают края пробирки или колбы в пламени горелки и выливают среду в чашку Петри с внесенным посевным материалом, соблюдая правила стерильной работы.
Распределяют равномерно посевной материал в питательной среде, для чего осторожно круговыми движениями перемещают чашку Петри по поверхности стола.
Оставляют чашку Петри на столе до полного застывания среды.
Делают на чашке Петри надпись (число, название микроорганизма). Все посевы, выполненные описанными способами, помещают в термостат для выращивания микроорганизмов при температуре, благоприятной для их роста.
2.1.2 Посев уколом в столбик агара или желатина
Пробирку с агаром или желатином держат дном кверху. Материал, подлежащий посеву, берут платиновой иглой, которую отвесно вка-лывают в поверхность агара или желатина и продвигают по оси про-
бирки до самого дна. Иглу затем извлекают, обжигают и закрывают пробирку пробкой (рисунок 3).

Рисунок 3 – Посев уколом
2.1.3 Пересев из пробирки в пробирку
2.1.3.1 Пересев на скошенный агар
Зажигают горелку. Пересевы проводят над пламенем горелки, чтобы теплый воздух препятствовал осаждению микроорганизмов из окружающего воздуха и отчасти их уничтожал (рисунок 4).

а, е – стерилизация петли; б – стерилизация краев пробирки;
в, г – взятие и посев материала; д – закрывание пробирок пробками
Рисунок 4 – Пересев микроорганизмов из пробирки в пробирку
Берут в правую руку бактериологическую петлю, с помощью которой осуществляют пересев (петлю держат как карандаш).
Стерилизуют бактериологическую петлю в пламени горелки, прокаливая проволоку докрасна, и одновременно обжигают примыкающую к петле часть держателя, который будет вводиться в пробирку с культурой микроорганизмов. При прокаливании петлю держат в пламени почти вертикально, чтобы вся проволока была раскалена.
Обе пробирки, т.е. ту, из которой производится пересев, и ту, которая подлежит засеву, берут вместе и держат между большим и указательным и средним пальцами левой руки. Причем пробирку со стерильной средой размещают дальше от себя, а с культурой микроорганизмов ближе к себе.
Не выпуская бактериологической петли из правой руки, мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижимают наружные концы ватных пробок к ладони и вынимают пробки из пробирок. Класть пробки на стол нельзя.
Слегка обжигают в пламени горелки края открытых пробирок.
Вводят в пробирку с культурой микроорганизмов петлю. Чтобы не повредить клетки микроорганизмов, петлю вначале охлаждают, прикасаясь к внутренней поверхности пробирки или к питательной среде, свободной от клеток микроорганизмов, и только после этого отбирают небольшое количество микробной массы.
Вынимают петлю и вводят ее в пробирку со стерильной питательной средой, избегая прикосновения со стенками пробирки.
Проводят петлей от дна вверх зигзагообразную или прямую
черту-штрих, слегка касаясь поверхности агара.
Обжигают ватные пробки и края пробирок одновременно в пламени и закрывают обе пробирки.
Обжигают петлю в пламени горелки.
2.1.3.2 Пересев культур микроорганизмов в жидкую среду
Из стерильной бумаги вынимают градуированную стерильную пипетку за верхний конец, берут пипетку средним и большим пальцами правой руки, не касаясь поверхности той части пипетки, которая будет вводиться в сосуд с жидкой средой.
Берут в левую руку пробирку (или колбу) с культурой микроорганизмов, выращенной в жидкой среде, и держат ее в вертикальном положении, чтобы не замочить пробку.
Открывают пробку, соблюдая все правила стерильности, описанные выше, и вводят пипетку в пробирку.
Набирают в пипетку суспензию микроорганизмов, закрывают пробкой пробирку (или колбу), вносят определенное количество суспензии в свежую стерильную питательную среду, соблюдая уже описанные правила предосторожности.
Пипетку помещают в сосуд с дезинфицирующим раствором (0,5…3%-ным водным раствором хлорамина или 3…5%-ным водным раствором фенола), не касаясь ею окружающих предметов.
Если пересев производят с помощью бактериологической петли, то материал, внесенный в жидкую питательную среду для посева, растирают на стенке пробирки ближе к жидкости и взбалтывают в ней.

Страница 13 из 91

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Посев на скошенный агар штрихом. Правой рукой берут петлю и прожигают ее на пламени горелки докрасна. Левой рукой между большим и указательным пальцами держат пробирку с агаром почти в горизонтальном положении, чтобы во время посева в нее не попадали микробы из воздуха. Легким вращательным движением освобождают ватную пробку и мизинцем правой руки, прижимая к ладони, вынимают ее из пробирки. Край пробирки слегка обжигают. Петлей забирают немного материала, содержащего микробов, и зигзагообразными движениями наносят на поверхность агара в пробирке. После произведенного посева петлю извлекают из Пробирки, обжигают ее края и закрывают ватной пробкой. Затем снова прожигают петлю в пламени горелки, чтобы уничтожить оставшихся на ней микробов.
Пересев на скошенный агар. Материал, содержащий микробов, также находится в пробирках. Для того чтобы сделать пересев из одной пробирки в другую, обе пробирки, т. е. ту, из которой производится посев, и ту, которая подлежит засеву, берут вместе и держат между большим и указательным и средним пальцами левой руки. Вынимают сначала пробки из пробирок по указанной выше методике, набирают материал и переносят материал на поверхность стерильного агара, где и производят посев, затем обжигают края пробирки и закрывают (рис. 33).
Посев на бульон. Посев на бульон или с бульона на бульон или агар делают так же, как и посев на агар, но все манипуляции следует производить осторожно, чтобы бульон не вылился из пробирки или не смочил ее краев. Материал, внесенный в бульон для посева, растирают на стенке пробирки ближе к жидкости и взбалтывают в бульоне. Пересев из бульона в бульон можно делать также при помощи стерильной пастеровской пипетки.
Посев в молоко и другие питательные (жидкие) среды производится так же, как и посев в бульон.
Посев уколом в столбик агара или желатины. Пробирку с агаром или желатиной держат дном кверху. Материал, подлежащий посеву, берут платиновой иглой, которую отвесно вкалывают в поверхность агара или желатины и продвигают по оси пробирки до самого дна. Иглу затем извлекают, обжигают и закрывают пробирку пробкой (рис. 34).

Во внешней среде и в организме человека микробы чаше всего встречаются в смеси с другими микробами. Для изучения свойств того или иного микроба (без чего не может быть поставлен диагноз) его нужно иметь в чистой культуре, т. е. приходится отделять его от других микробов, с которыми он смешан.

Рис. 33. Посев петлей.

Рис. 34. Посев уколом.

Рис. 35. Заливка чашки агаром.
Существуют следующие методы выделения чистых культур бактерий:
а) посев на среду в чашку Гейденрейха - Петри;
б) биологические методы (применение элективных сред, использование различных оптимальных температур, заражение лабораторных животных). Наиболее часто пользуются посевом исследуемого материала на среду в чашки Гейденрейха - Петри.

Техника посева на чашку Гейденрейха - Петри с застывшим агаром. Агар в колбах, флаконах, пробирках расплавляют в кипящей водяной бане. Затем агар охлаждают до 50-60° и разливают в чашки Гейденрейха - Петри. Чашки должны быть стерильными. Их устанавливают на горизонтальной поверхности, и из сосуда, содержащего расплавленный агар, вынимают пробку, края сосуда обжигают, после чего среду выливают в чашку (рис. 35). Крышку чашки приподнимают левой рукой с одной стороны, не открывая чашки полностью. Слегка наклоняя чашку в разные стороны, распределяют налитый в нее агар ровным слоем по всему дну. Когда агар затвердеет, чашки ставят в термостат вверх дном для подсушивания. Полезно также удалить стерильной ватой конденсационную воду, собирающуюся на крышке чашки. Посев на чашки с агаром производят штрихом при помощи петли или втиранием стеклянным шпателем. Для его изготовления стеклянную палочку необходимой толщины (4- 5 мм) вводят в пламя горелки, нагревают до размягчения, конец обжимают предварительно нагретыми плоскозубцами и придают форму треугольника (рис. 36). Практически удобнее пользоваться металлическими шпателями Дригальского.

Посев петлей производится следующим образом. Платиновой петлей набирают небольшое количество материала, легко проводят по поверхности агара, нанося ряд параллельных линий. Той же петлей, не набирая материала, вновь наносят штрихи на второй и третьей чашке с агаром. На первой чашке может получиться сплошной рост, тогда как на второй и третьей наблюдается рост единичных, изолированных колоний. Каждая колония представляет обособленное скопление однородных микробов. Можно также пользоваться одной чашкой, разделив ее на несколько секторов, нанеся линии деления по стеклу дна чашки.

Рис. 36. Шпатель Дригальского.
Каждый отдельный сектор будет заменять одну чашку. При последующем пересеве из колоний на косой агар или другую питательную среду получают чистую культуру.
При посеве шпателем на поверхность агара наносят петлей одну каплю исследуемого материала. Затем, приоткрыв чашку, прокаленным и остуженным стеклянным шпателем растирают каплю по всей поверхности, производя легкие поглаживающие движения по всей поверхности агара (рис. 37). Не обжигая шпателя, им же засевают вторую и третью чашки с агаром.

Рис. 37. Посев шпателем.

Биологические методы выделения чистых культур. Выделение чистых культур на основе различных биологических свойств бактерий широко проводится на специальных питательных средах. Например, специальные среды нашли широкое применение при выделении возбудителей кишечных инфекций. Добавление к питательной среде малахитового или бриллиантового зеленого, солей желчных кислот, значительных концентраций поваренной соли или лимоннокислых солей подавляет рост кишечной палочки и не влияет на размножение патогенных бактерий кишечнотифозной группы. Для выделения из мокроты и слизи культуры коклюшной палочки к питательной среде добавляют антибиотик пенициллин, который угнетает рост сопутствующей микрофлоры и в то же время не задерживает роста и размножения возбудителя коклюша. Для выделения холерного вибриона используют элективную среду - пептонную воду, а для выделения дифтерийной палочки - свернутую лошадиную сыворотку.

Для облегчения выделения чистых культур некоторых бактерий можно воспользоваться и тем, что они растут при различных температурных оптимумах. В качестве примера можно привести метод выделения чистой культуры кишечной палочки из воды путем выращивания посевов в термостате при температуре 43°, выделение возбудителя чумы из загрязненного материала путем выращивания при 20° и даже при 5°.
Наконец, следует указать, что рост некоторых патогенных бактерий (пневмококк, бациллы сибирской язвы, бактерии туляремии и др.) можно получить в чистой культуре, заражая лабораторных животных, чувствительных к тому или другому микробу. Например, для выделения культуры пневмококка из мокроты больного человека производится заражение белой мыши.

Термостат

Рис. 38. Термостаты.

Засеянную среду помещают в термостат, где температура наиболее благоприятна для выращивания микробов. Для патогенных микробов эта температура должна соответствовать температуре человеческого тела, т. е. 37°. Электрические термостаты с автоматическим регулированием температуры бывают различных размеров- от величины небольшого ящика до величины комнаты. Термостат для обычной бактериологической работы представляет собой шкаф с двойными стенками из металла или дерева, обшитый снаружи плохими проводниками тепла, например, пробкой, асбестом и т. п. (рис. 38). Термостат имеет двойную дверку, наружную, обшитую изолирующим слоем, и внутреннюю в виде рамки со стеклом. Внутри термостата устроены съемные полки из металлической сетки.

8.1. Способы размножения бактерий

Термины «размножение бактерий» и «рост бактерий» часто используют как синонимы, хотя эти термины обозначают, строго говоря, разные явления. Под ростом бактерий понимают увеличение размеров бактериальной клетки, а под размножением бактерий – увеличение числа бактериальных клеток. Однако когда имеют в виду бактериальную популяцию в целом, то в этом случае термином «рост» обозначают увеличение количества особей в популяции. В последнем случае корректней использовать термин «рост бактериальной культуры».

А. Основной способ размножения для большинства бактерий – бинарное деление .

1. У грамположительных бактерий бинарное деление происходит путем формирования перегородки от противоположенных концов клеточной стенки к центру, где обе части перегородки сливаются, сформировав тем самым две самостоятельные клетки.

2. У грамотрицательных бактерий бинарное деление происходит путем образования перетяжки : клетка как бы истончается посередине, пока не разорвется на две самостоятельные клетки.

Б. Ряд бактерий могут делиться путем почкования (например, франциселлы, микоплазмы).

В. Те бактерии, которые формируют нитевидные формы, могут делиться путем их фрагментации (например, актиномицеты, микоплазмы).

Г. У стрептомицетов существует способ размножения экзоспорами .

Д. У хламидий существует особый цикл развития (см. ниже).

8.2. Цикл развития хламидий

А. Элементарное тельце выполняет инфекционную функцию – проникает в клетку-хозяина путем инвагинации места адсорбции.

Б. Ретикулярное (или инициальное) тельце размножается бинарным делением в образовавшемся цитоплазматическом пузырьке и формирует микроколонию, которая видна при микроскопии как цитоплазматическое включение.

В. Переходную форму от ретикулярного тельца к тельцу элементарному представляет промежуточное тельце. После того, как в микроколонии сформировалось множество новых элементарных телец, она сливается с клеточной мембраной и «изливается» наружу «урожаем» размножившихся хламидий, элементарные тельца которых отправляются на поиски новых клеток-хозяев.

8.3. Культивирование микроорганизмов и классификация искусственных питательных сред

Есть два основных принципа культивирования микроорганизмов – invivo и invitro.

1. В зависимости от их консистенции искусственные питательные среды классифицируются на плотные, полужидкие и жидкие (Рис. 8-3).

а. Плотные питательные среды могут быть агаризованные и свернутые.

1 . Агаризованные питательные среды называются так потому, что в качестве уплотнителя в их состав вводят агар – полисахарид, добываемый из морских водорослей определенных видов и используемый для уплотнения питательных сред в бактериологии по такому же алгоритму, как в быту крахмал или желатин. Для получения плотной питательной среды достаточно концентрации агара в пределах 1,5 – 2%. При этом могут использоваться или чашки Петри («пластинчатый агар») или пробирки (при наличии скоса –«скошенный агар» или «косяк», при его отсутствии – «столбик агара»).

2 . Свернутые питательные среды – это плотные среды, содержащие сыворотку крови или обогащенные другим белком (яичные, например), которые уплотняются (как результат денатурации белка) при их прогревании в процессе стерилизации.

б. Полужидкие питательные среды содержат небольшое количество агара (примерно 0,5%).

в. Жидкие питательные среды не содержат уплотнителей. В принципе, любую жидкую среду можно превратить в плотную, или добавив к ней агар, или свернув содержащийся в ней белок (соблюдая в обоих случаях необходимую концентрацию уплотнителя).

2. По своему составу искусственные питательные среды классифицируются на натуральные и синтетические.

а. Натуральные искусственные питательные среды готовятся на основе отваров или экстрактов мяса, рыбы, овощей и др. натуральных продуктов. Натуральные питательные среды, свою очередь, классифицируют на простые и сложные. Именно преимущественно натуральные питательные среды используются в работе бактериологических лабораторий так называемого «практического здравоохранения».

1 . Простые натуральные питательные среды, собственно, и представляют собой такие отвары или экстракты. К простым натуральным питательным средам относятся:

– мясопептонный агар (МПА) и мясопептонный бульон (МПБ), относящиеся к одной группе, так как агар не усваивается подавляющим большинством бактерий, и, следовательно, он не изменяет состав среды – только ее концентрацию;

– желатин;

– молоко;

– кусочки овощей.

2 . Сложные натуральные питательные среды получают путем добавления в простые натуральные среды любого вещества (красителя, сахара, антибиотика, крови и т.д.).

б. Синтетические искусственные питательные среды получают, смешивая в растворе чистые химические вещества (как правило, соли). В отличие от натуральных питательных сред, это так называемые среды известного состава, так как количество содержащихся в них веществ точно задается рецептурой их приготовления. Синтетические искусственные питательные среды используются в основном в бактериологических лабораториях научных учреждений.

3. По своему назначению искусственные питательные среды классифицируются на основные, элективные (селективные), дифференциально-диагностические и консервирующие.

а. Основные искусственные питательные среды названы так потому, что с их помощью проводится основная работа бактериолога – накопление чистой культуры, ее «оживление» после длительного хранения и т.п. Основные питательные среды, в свою очередь, подразделяются на универсальные и специальные.

1 . Одна и та же универсальная основная питательная среда может быть использована для культивирования многих видов бактерий. По своему составу это – простые натуральные питательные среды. Бактерии, которые можно культивировать на таких средах, называются бактериями с простыми питательными потребностями.

2 . Специальная основная питательная среда используется для культивирования конкретного вида или группы бактерий. Бактерии, которые для своего культивирования нуждаются в специальных питательных средах, называются бактериями со сложными питательными потребностями.

б. Элективные (селективные, избирательные, обогащенные) искусственные питательные среды – это среды, содержащие вещества, используемые бактериями определенных видов и не благоприятствующие или даже препятствующие росту других бактерий. Такие среды служат для выделения конкретного вида бактерий из патологического материала. Выделение тех виды бактерий, для которых такие среды не разработаны, довольно затруднительно.

в. Дифференциально-диагностические искусственные питательные среды – это среды, позволяющие отличать одни виды бактерий от других по их ферментативной активности (чаще всего – по цвету образуемых ими колоний) или культуральным свойствам.

г. Консервирующие искусственные питательные среды – это среды, используемые, например, при доставке патологического материала в бактериологическую лабораторию; так как метаболическая активность на них бактерий сводится практически к нулю, то бактерии сохраняются, но не размножаются.

8.4. Требования к условиям культивирования бактерий

Для, того, чтобы успешно культивировать бактерии на искусственных питательных средах, необходимо учитывать не только их питательные потребности (простые или сложные, о чем было сказано выше), но и температуру культивирования, реакцию среды (рН), а также необходимые конкретному виду условия аэрации.

А. По оптимальной температуре культивирования бактерии классифицируются на три группы: термофилы, мезофилы и психрофилы.

1. Оптимальная температура культивирования термофилов составляет 50 – 60°С. По понятным причинам термофилы не составляют предмет изучения медицинской микробиологии.

2. Подавляющее большинство бактерий, имеющих медицинское значение, лучше всего растут при температуре человеческого организма, т.е. 37°С. Такие бактерии называются мезофилами .

3. Ряд патогенных для человека бактерий лучше всего растут при более низких температурах (от 6 до 20°С) и называются психрофилами .

Б. В зависимости от необходимой реакции питательной среды бактерии подразделяются на три основные группы, для обозначения двух из которых используются особые термины.

1. Те из них, которые лучше всего растут на кислых питательных средах, называются ацидофилами .

2. Бактерии, для культивирования которых необходимо использовать щелочные среды, называются алкалифилами .

3. Подавляющее большинство патогенных для человека бактерий растут на средах с нейтральным рН. Для обозначения этой группы бактерий никаких особых терминов не используется.

В. По требованиям к условиям аэрации во время культивирования, бактерии можно разделить на четыре основные группы.

1. Облигатные аэробы требуют во время культивирования постоянного доступа воздуха к поверхности питательной среды.

2. Анаэробы , наоборот, культивируются в безвоздушной среде.

3. Особого газового состава для своего культивирования требуют микрофилы (сниженного содержания кислорода) и капнофилы (повышенного содержания углекислого газа).

4. Факультативные анаэробы растут при любых условиях аэрации.

8.5. Характер роста бактерий на искусственных питательных средах

Характер роста бактерий зависит, прежде всего, от того, какая питательная среда – жидкая или плотная – используется для культивирования.

А. На жидких питательных средах (например, мясопептонном бульоне) для всего многообразия бактерий можно выделить четыре формы роста.

1. Большинство бактерий формируют диффузную муть (Рис. 8-4).

2. Так называемые «коховские бактерии», названные так потому, что их основные патогенные представители были открыты Кохом, – бациллы, микобактерии и вибрионы – образуют на поверхности бульона пленку .

3. Для стрептококков характерен так называемый придонный или пристеночный рост – осадок или мелкие хлопья у стенки пробирки при прозрачном бульоне.

4. Возбудитель чумы – Yersiniapestis – растет в виде пленки на поверхности бульона, от которой спускаются тяжи , похожие на сталактиты, может формироваться и осадок.

Б. На плотных питательных средах (например, мясопептонном агаре) рост бактерий зависит от способа их засева.

1. Если плотность засева большая, то бактерии формируют на поверхности агара сплошной налет – так называемый, «рост газоном » или «сливной рост».

2. Если засев проводится таким образом, что каждая бактериальная клетка лежит на поверхности агара на большом расстоянии от других, то, после многократных делений она формирует изолированную колонию (говорят еще об «изолированном росте »). А так, как колония – результат размножения одной клетки, то ее, с некоторыми допущениями, рассматривают как клональную культуру. Именно из материала отдельной, изолированной, колонии в процессе культурального метода исследования получают так называемую «чистую культуру» – культуру, содержащие клетки только одного вида. Все огромное многообразие, по их внешнему виду, колоний (Рис. 8-5) можно свести к двум основным типам.

а. S -форма колонии («гладкая») – гомогенная, с ровными краями, куполообразная, влажная, прозрачная или полупрозрачная. Все S-форма колоний схожи друг с другом, отличаясь у разных видов бактерий или их вариантов размером, а в случае пигментообразования или роста на дифференциально-диагностических средах – и цветом. S-форму колоний образуют:

– грамотрицательные палочки, кроме возбудителя чумы (Yersiniapestis).

б. R -форма колоний («шероховатая») – не гомогенная, с неровными краями, с самыми разнообразными вариантами расположения относительно поверхности питательной среды (от возвышающейся над ней до погруженной в нее, т.е. находящейся ниже поверхности питательной среды), непрозрачная. R-формы колоний различных бактерий могут резко отличаться друг от друга, для их описания порой используют сравнительный обороты (говорят, например, о колониях, похожих на цветок маргаритки у возбудителя дифтерии, похожих на цветную капусту или бородавку – у возбудителей туберкулеза и т.п.). R-форма колоний образуют:

– грамположительные палочки,

– возбудитель чумы (Yersinia pestis).

8.6. Стадии роста периодической бактериальной культуры

При выращивании бактерий в жидкой питательной среде можно постоянно отбирать выросшую бактериальную массу, удалять продукты метаболизма бактерий и добавлять новую полноценную питательную среду. Т.е. постоянно поддерживать оптимальные условия культивирования. В этом случае культура будет постоянно расти с максимальной скоростью. Такая культура называется хемостатной, потому что для ее получения используют специальные приборы - хемостаты, – которые и дают возможность совершать вышеописанные манипуляции. Такие культуры используются в промышленной микробиологии для получения полезных веществ – продуктов микробного метаболизма (антибиотиков, аминокислот и т.д.). Если же бактериальная культура выращивается в пробирке (именно такой способ используется в медицинской микробиологии), то с течением времени в питательной среде накапливаются продукты бактериального метаболизма, а питательная среда, наоборот, истощается. В результате, чтобы культура не погибла, ее необходимо периодически пересевать на свежую питательную среду. Такая культура называется периодической. В своем росте она проходит девять стадий (фаз) развития.

А. После внесения в питательную среду инокулята (посевной дозы), наступает лаг-фаза (Рис. 8-6). Деление клеток на этой стадии не происходит – бактерии как бы приспосабливаются к новой среде обитания; при этом некоторое количество их может погибнуть.

Б. Затем наступает фаза положительного ускорения (Рис. 8-7). Бактериальные клетки начинают делиться и скорость их деления постоянно увеличивается.

В. Наконец, скорость деления клеток достигнет максимального значения и останется таковой некоторое время (Рис. 8-8). Это экспоненциальная фаза (фаза логарифмического роста ).

Г. Однако, со временем количество питательных веществ в среде снижается, а концентрация продуктов метаболизма бактериальных клеток увеличивается. В результате условия для размножения и роста бактерий ухудшаются, и скорость деления бактериальных клеток снижается – наступает фаза отрицательного ускорения (Рис. 8-9). Однако, на этой стадии количество живых бактериальных клеток в культуре все еще увеличивается, правда с постоянно снижающейся скоростью.

Д. Стадия, во время которой в каждый конкретный момент времени количество вновь появившихся живых бактериальных клеток равно количеству погибших, называется стационарной фазой максимума (Рис. 8-10). Бактериальная культура, достигшая в этой фазе роста максимально возможной при данных условиях культивирования концентрации живых бактериальных клеток, называют остановившейся .

Е. Затем количество живых бактериальных клеток начинает уменьшаться с увеличивающейся скоростью. Эта стадия роста бактериальной культуры называется фазой ускоренной гибели (Рис. 8-11).

Ж. Стадия, во время которой эта скорость убывания живых бактериальных клеток становится максимальной, называется фазой логарифмической гибели (Рис. 8-12).

З. Со временем, однако, эта скорость начинает уменьшаться – наступает фаза уменьшения скорости гибели (Рис. 8-13).

И. В конце концов культура некоторое время будет состоять из минимального количества живых бактериальных клеток. Эта стадия роста бактериальной культуры называется стационарной фазой минимума (Рис. 8-14). Время, которое бактериальная культура сможет продержаться до своей гибели на этот минимуме, зависит как от вида микроорганизмов, так и от условий культивирования.

8.7. Методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий

В зависимости от способа создания безвоздушной среды, все методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий делят на физические, химические и биологические. Особняком стоит метод Китта-Тароцци, сочетающий в себе физические, химические и биологические способы создания безвоздушной среды обитания микроорганизмов.

А. Воздух, точнее кислород воздуха, можно удалить из среды культивирования бактерий физическими методами.

1. Можно использовать анаэростат – сосуд с герметической крышкой, из которого отсасывают воздух насосом. В такой сосуд помещают чашки Петри с посевами и после откачивания воздуха ставят (если он по своим размерам позволяет это сделать – такие небольшие анаэростаты называются микроанаэростатами) в термостат, где происходит культивирование бактерий.

2. Существуют, по сути, разновидности анаэростатов, в которых удаленный воздух замещается каким-нибудь инертным газом, например – в аппарате Кипа – водородом.

3. Один из наиболее распространенных способов создания анаэробных условий при культивировании бактерий используется в так называемых трубках Виньяль-Вийона . Этот метод прост в осуществлении и не требует какой-либо особой аппаратуры. В трубках Виньяль-Вийона осуществляется глубинное культивирование бактерий. Для этого бактериальная культура разводится в расплавленной и охлажденной питательной среде (в пробирках или пипетках – отсюда и название «трубки») с таким расчетом, чтобы бактериальные клетки находились на значительном удалении одна от другой. При застывании питательной среды бактериальные клетки оказываются «замурованными» в ее толще и при культивировании каждая из них формирует отдельную колонию (естественно, без доступа кислорода воздуха).

4. Анаэробные условия для культивирования бактерии создаются и в случае их засева уколом в высокий столбик полужидкого агара. Место укола тут же затягивается и бактерии растут в толще питательной среды.

5. Удалить воздух, растворенный в жидкой питательной среде, можно с помощью кипячения. При нагревании жидкости растворенный в ней воздух выходит в атмосферу, что мы и наблюдаем в виде «бурления». Такой процесс называется регенерацией питательной среды. Чтобы впоследствии при медленном охлаждении воздух вновь не растворился в питательном бульоне, его охлаждают очень быстро (например, под струей холодной воды).

6. Чтобы свести к минимуму диффузию атмосферного воздуха в питательную среду, ее поверхность покрывают слоем жидкого масла (например, вазелинового). В этом случае говорят о «культивировании под слоем масла ».

7. При глубинном культивировании бывает трудно получить доступ к нужной колонии и извлечь ее из толщи питательной среды. Облегчает эту задачу метод Перетца : в чашку Петри заливается расплавленная и охлажденная питательная агаризованная среда, смешанная с бактериальной культурой, на поверхность которой осторожно помещается предметное стекло, которое слегка вдавливают в питательный агар. Те колонии, которые вырастают непосредственно под этим стеклом, после снятия последнего становятся легко доступными.

Б. Химические методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий делятся на две группы.

1. Для связывания кислорода воздуха можно провести в замкнутом объеме (например, в эксикаторе с притертой крышкой) химическую реакцию, которая протекает с поглощением воздуха .

а. В методе Аристовского с этой целью используются сыпучие ингредиенты. В развитие этого метода современная микробиологическая промышленность выпускает специальные наборы, с помощью которых можно создать газовую смесь, как с полным отсутствием кислорода, так и с присутствием его, а также углекислого газа и азота, в определенных концентрациях, необходимых для культивирования бактерий с «нестандартными» требованиями к условиям аэрации.

б. В методе Омелянского с этой целью используются жидкие ингредиенты (пирогаллол и едкое кали).

2. Можно добавить в жидкую питательную среду вещества, связывающие кислород. Такие вещества называются редуцирующими . К ним относится, например, глюкоза, тиогликолевая кислота и ряд других.

В. В качестве биологического метода создания анаэробных условий для культивирования бактерий наиболее распространен (в различных модификациях) метод Фортнера . Принцип его состоит в том, что в замкнутом объеме (например, в парафинированной чашке Петри) одновременно культивируются анаэробы и так называемый «жадный аэроб» – вид бактерий, усиленно поглощающий при своем росте кислород. В качестве последнего наиболее часто используется энтеробактерия Serraciamarcescens. Аэроб уничтожает весь кислород замкнутого объема, создавая тем самым условия для роста анаэроба.

Г. Метод Китта-Тароцци заключается в использовании для культивирования анаэробов одноименной питательной среды. Среда Китта-Тароцци состоит из мясопептонного бульона, содержащего глюкозу (в качестве редуцирующего вещества), регенерированного и залитого слоем масла, на дно пробирки помещают кусочки паренхиматозного органа (чаще – печени) для адсорбции растворенного в мясопептонном бульоне воздуха.

Физиология и принципы культивирования микроорганизмов.

Метаболизм микроорганизмов.

Для роста и размножения микроорганизмы нуждаются в веществах, используемых для построения структурных компонентов клетки и получения энергии. Метаболизм (т.е. обмен веществ и энергии) имеет две составляющих- анаболизм и катаболизм . Анаболизм- синтез компонентов клетки (конструктивный обмен ). Катаболизм- энергетический обмен, связан с окислительно- восстановительными реакциями, расщеплением глюкозы и других органических соединений, синтезом АТФ. Питательные вещества могут поступать в клетку в растворимом виде (это характерно для прокариот) — осмотрофы , или в виде отдельных частиц- фаготрофы .

Основным регулятором поступления веществ в бактериальную клетку является цитоплазматическая мембрана. Существует четыре основных механизма поступления веществ: -пассивная диффузия — по градиенту концентрации, энергонезатратная, не имеющая субстратной специфичности;

— облегченная диффузия — по градиенту концентрации, субстратспецифичная, энергонезатратная, осуществляется при участии специализированных белков пермеаз ;

— активный транспорт- против градиента концентрации, субстратспецифичен (специальные связывающие белки в комплексе с пермеазами), энергозатратный (за счет АТФ), вещества поступают в клетку в химически неизмененном виде;

— транслокация (перенос групп) — против градиента концентрации, с помощью фосфотрансферазной системы, энергозатратна, вещества (преимущественно сахара) поступают в клетку в форфорилированном виде.

Дыхание микроорганизмов.

Аэробное дыхание донор водорода H 2 O

Анаэробное дыхание

Нитратное окисление NO 3

(факультативные анаэробы) донор водорода N 2

Сульфатное окисление SO 4

(облигатные анаэробы) донор водорода H 2 S

По типу дыхания выделяют четыре группы микроорганизмов.

1.Облигатные (строгие) аэробы . Им необходим молекулярный (атмосферный) кислород для дыхания.

3.Факультативные анаэробы могут потреблять глюкозу и размножаться в аэробных и анаэробных условиях. Среди них имеются микроорганизмы, толерантные к относительно высоким (близких к атмосферным) концентрациям молекулярного кислорода — т.е. аэротолерантные, а также микроорганизмы которые способны в определенных условиях переключаться с анаэробного на аэробное дыхание.

Аэробное дыхание энергетически более эффективно (синтезируется большее количество АТФ).

В процессе аэробного дыхания образуются токсические продукты окисления (H 2 O 2 — перекись водорода, -О 2 — свободные кислородные радикалы), от которых защищают специфические ферменты, прежде всего каталаза, пероксидаза, пероксиддисмутаза . У анаэробов эти ферменты отсутствуют, также как и система регуляции окислительно- восстановительного потенциала (rH 2 ).

Основные методы создания анаэробных условий для культивирования микроорганизмов.

1.Физический- откачивание воздуха, введение специальной газовой безкислородной смеси (чаще- N 2 — 85%, CO 2 — 10%, H 2 — 5%).

2.Химический- применяют химические поглотители кислорода.

4.Смешанный- используют несколько разных подходов.

Основные принципы культивирования микроорганизмов на питательных средах.

1.Использование всех необходимых для соответствующих микробов питательных компонентов.

По температурному оптимуму роста выделяют три основные группы микроорганизмов.

1.Психрофилы- растут при температурах ниже +20 градусов Цельсия.

2.Мезофилы- растут в диапозоне температур от 20 до 45 градусов (часто оптимум- при 37 градусах С).

3.Термофилы- растут при температурах выше плюс 45 градусов.

Краткая характеристика питательных сред.

По консистенции выделяют жидкие, плотные (1,5- 3% агара) и полужидкие (0,3- 0,7 % агара) среды.

Агар- полисахарид сложного состава из морских водорослей, основной отвердитель для плотных (твердых) сред. В качестве универсального источника углерода и азота применяют пептоны — продукты ферментации белков пепсином, различные гидролизаты- мясной, рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.

По назначению среды разделяют на ряд групп:

— универсальные (простые), пригодные для различных нетребовательных микроорганизмов (мясо- пептонный бульон- МПБ, мясо- пептонный агар- МПА);

— специальные- среды для микроорганизмов, не растущих на универсальных средах (среда Мак- Коя на туляремию, среда Левенштейна- Иенсена для возбудителя туберкулеза);

— дифференциально- диагностические- для дифференциации микроорганизмов по ферментативной активности и культуральным свойствам (среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гисса);

— селективные (элективные) — для выделения определенных видов микроорганизмов и подавления роста сопутствующих- пептонная вода, селенитовая среда, среда Мюллера.

По происхождению среды делят на естественные, полусинтетические и синтетические.

Рост и размножение микроорганизмов.

— лаг- фаза (начальная стадия адаптации с медленным темпом прирости биомассы бактерий);

— экспоненциальная (геометрического роста) фаза с резким ростом численности популяции микроорганизмов (2 в степеии n);

— стационарная фаза (фаза равновесия размножения и гибели микробных клеток);

— стадия гибели — уменьшение численности популяции в связи с уменьшением и отсутствием условий для размножения микроорганизмов (дефицит питательных веществ, изменение рH, rH 2 , концентрации ионов и других условий культивирования).

Чистая культура — популяция одного вида микроорганизмов.

принципы культивирования микроорганизмов. Как лечить болезнь?
принципы культивирования микроорганизмов. Народные способы лечения и исцеления.
Уникальные исцеляющие видео-сеансы.